Anne de Cleves (1515–1557), fille de Jean III, duc de Cleves, est la quatrième épouse d'Henri VIII. Holbein a été envoyé pour la peindre à Düren en été 1539, afin qu'Henry puisse l'évaluer comme une épouse possible. Holbein pose Anne carrément et en finesse élaborée. Henry était déçu par sa chair, et il l'a divorcée après un bref mariage non consommé. Il rebaptisa Anne comme « sœur du roi », et elle resta en Angleterre, où elle mourut sous le règne de la reine Marie. L'utilisation du parchemin suggère que Holbein a peint, ou du moins a commencé, le portrait à Düren. Une version miniature du Victoria and Albert Museum a probablement été peinte en même temps. Holbein a également réalisé un portrait de la sœur d'Anne, Amelia, qui est maintenant perdue. Nicholas Wotton, le chef de la délégation anglaise, rapporta à Henry: "La servante de votre Grâce Hanze Albein hase a pris les effets de ma dame Anne et la dame Amelye et a exprimé les images très lyvely". La tradition que Holbein flattait Anne n'est pas confirmée par la preuve : personne, sauf Henry, ne l'a jamais décrite comme répugnante.